糖蛋白在人体蛋白质中占比超过50%，并且是大多数生物制药的关键成分。作为最广泛和复杂的翻译后修饰（PTM）之一，蛋白质的糖基化对调节众多生物过程至关重要。对糖蛋白的一级序列进行全面分析，包括糖基化位点的识别及其相关聚糖结构，是研究糖蛋白功能的核心。

液相色谱-质谱法（LCMS/MS）已成为鉴定蛋白质及其翻译后修饰的重要工具。相较于糖蛋白质组学中的传统数据库搜索策略，蛋白质从头测序是一种崭新的方法，它不需要预先了解DNA或氨基酸序列。然而，复杂的糖基化位点常导致序列覆盖不全，并使得获得足够信息的糖肽碎裂谱变得困难，限制了从头测序在具有特定结构和已知N连接糖基化位点的单克隆抗体（mAb）中的应用。

在2025年发布于JACSAu（IF86）的一项研究中，题为“解码蛋白质糖基化的综合质谱基础从头测序策略”，阐述了如何通过质谱技术探测未知糖蛋白。此方法结合了糖基释放介导的从头测序与糖基化位点的详细表征。作者采用N-/O-糖的去糖基化策略实现了全面的序列覆盖，同时结合电子转移高能碰撞解离（EThcD）技术，能够鉴定出高质量的长肽，以便更准确地组装蛋白质。

该研究进一步应用于复杂糖基化的生物药物依那西普及其他三种序列未知的新型肿瘤坏死因子受体：Fc融合生物制剂，揭示了它们的一级序列存在微妙差异。此外，针对这些蛋白质的N和O糖基化修饰进行了细致的亚基、糖肽和聚糖层面的表征。

通过该研究策略，成功弥合了从头测序与糖基化修饰之间的差距，为糖蛋白的一级结构及糖基化修饰提供了详尽信息。这种方法作为糖蛋白准确测序的可靠解决方案，不仅在基础研究领域展现出实用价值，在生物制药行业也同样意义重大。

研究方法包括：使用N-糖苷酶F（PNGaseF）去除N-聚糖，内切α-N-乙酰半乳糖胺酶（EngEF）去除O-聚糖，并结合唾液酸酶，以确保去糖基化的有效性。同时通过完整质量分析验证去糖基化的结果。此外，采用EThcD技术获得高质量的肽段，并使用PEAKSAB对其序列进行分析。在18O环境下利用PNGaseF将糖基化的Asn转化为Asp并进行标记，以实现对N-糖基化位点的定量分析。使用内切糖苷酶混合物C（EndoCC、EndoS和EndoH）处理样本后，分析质谱数据，验证了N糖基化位点的鉴定结果。

在本研究中，作者提出了一种基于综合质谱法的从头解码蛋白质糖基化的方法，并使用在唾液酸化的常用模型糖蛋白Fetuin-A（UniProt Accession no P12763）上开发了糖蛋白的从头测序策略。通过糖苷酶水解糖苷键简化质谱分析及肽序列，并从去糖基化的蛋白中获得一级序列。随后的验证表明该方法在复杂糖基化生物制药依那西普中的有效性。

如此一来，依托于从头测序方法的稳定性，成功对已上市的高度糖基化Fc融合蛋白依那西普进行了测序，揭示了其与三种新型TNFR：Fc生物制剂的一级序列的细微差异。通过多维度的糖基化分析，包括N-糖基化位点鉴定、游离寡糖分析、糖蛋白亚基分析及糖肽分析，作者找到了N/O糖基化的定位及其特征。

结论上，基于质谱的蛋白质从头测序为揭示氨基酸序列提供了一种可靠的手段，结合糖苷酶酶解及EThcD碎裂显著提升了蛋白质测序的准确性和糖基化表征。此创新策略为深入理解高度糖基化蛋白质提供了新的视角，并为未来分析各种生物药物的成功奠定了基础。这对于生物医药的发展及治疗多种疾病的努力均起到了推动作用。

在生物制药行业不断发展的背景下，

秉持现代科技与创新相结合的理念，将帮助推动新药研发，提高治疗效果从而造福广大患者。