在之前发布的文章中，我们已经了解到慢病毒在基因传递中的重要作用。慢病毒能够有效地将外源基因整合到宿主染色体上，实现长期表达，同时也能高效感染几乎所有哺乳动物细胞、干细胞和原代细胞。这些优点使得慢病毒成为基因传递领域中一款强大且有效的工具，得到了广泛应用。那当我们拿到包装好的慢病毒后，该如何进行后续操作呢？今天，我将为大家详细介绍从获得慢病毒后的操作步骤，内容丰富，值得一看。

病毒的储存

包装好的慢病毒建议在分装后，放置于-80℃冰箱中保存，储存期限为半年。如超过半年，推荐使用前重新测定滴度。如果短期内（3-5天）需要使用，可以将慢病毒置于4℃冷藏。在使用过程中，尽量避免反复冻融，以免降低病毒滴度。可以根据实验所需的用量进行合理分装。

病毒的稀释

如果需要稀释病毒，可以先将其在冰浴中解冻，然后用PBS或不含血清的培养基混匀稀释，最后在4℃下保存。为了确保病毒滴度，建议在3天内使用完。

预实验摸索最佳MOI

不同细胞对慢病毒的敏感性各有不同，因此在正式实验前，需要通过预实验确定慢病毒感染细胞的复数（MOI）及最佳的感染条件。这包括接种细胞的数量、感染时的总体积和换液时间等，以确保正式实验能够获得理想结果。

感染预实验的步骤如下：

• 第1天：将健康生长的目标细胞以1×10⁴个/孔接种于96孔板中，放入37℃、5% CO₂培养箱中培养过夜。
• 第2天：根据实验需要或文献中的MOI值，设置梯度范围一般为3-100。将-80℃冰箱取出的病毒在冰浴中融化，按照设定的MOI值计算每孔所需的病毒原液量。
• 第3天：更换培养液，一般在病毒感染16-24小时后，将含有慢病毒的培养液替换为正常培养液，继续培养。
• 第4-5天：使用倒置荧光显微镜观察感染后48-72小时的细胞荧光，评估慢病毒的感染效率，并确定适合的MOI值，用于正式实验。

进行正式感染实验

预实验确定了慢病毒对靶细胞的亲和性及合适的MOI值后，可以进行正式的感染实验。以在24孔板中用含有GFP荧光标记和Puromycin抗性的慢病毒感染细胞为例，具体操作步骤如下：

1. 根据实验需要将细胞接种到24孔板中，密度以5-10×10⁴ cells/孔为宜，37℃培养过夜。
2. 第二天，从-80℃冰箱取出病毒并解冻，根据预实验得到的MOI值稀释病毒液。
3. 吸去细胞原有培养基，将按照MOI稀释好的病毒液加入细胞中，若需要，添加Polybrene，轻轻混匀后在37℃培养过夜。
4. 感染16-24小时后，吸除含慢病毒的培养基，换为新鲜的培养基。
5. 培养48-72小时后，收集细胞以检测目的蛋白的表达。

构建稳转株

成功感染细胞后，带有不同抗性的慢病毒能使细胞在含有抗生素的培养基中存活，而未感染的细胞则无法生存。在抗性筛选压力下，可筛选出稳定表达目的基因的细胞株。以带有Puromycin抗性的慢病毒为例：

• 在感染48-72小时后（70-80%汇合度），继续在含有适当浓度Puromycin的培养液中培养，并每3-4天更换一次培养液，直到未感染的对照细胞被完全杀死。
• 收集并对筛选的细胞进行qPCR或Western Blot来鉴定目的基因的表达水平。正常结果的细胞需冻存保种。

在进行单克隆稳转株的筛选时，需对感染后的细胞进行稀释培养。挑选单一细胞生成的细胞克隆，并进行扩大培养，确保获得性状单一且表达稳定的细胞株。每一步操作都需谨慎，以保障实验的成功。

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