### 细胞裂解液的制备

#### 一、试剂准备

1. 新鲜配制冷的RIPA裂解缓冲液:

• 150 mM NaCl
• 1% NP-40（去垢剂）
• 0.1% SDS（去垢剂）
• 2 µg/ml Aprotinin（蛋白酶抑制剂，使用前加入）
• 2 µg/ml Leupeptin（蛋白酶抑制剂，使用前加入）
• 1 mM PMSF（蛋白酶抑制剂）
• 15 mM EDTA（蛋白酶抑制剂）
• 1 mM Na Vanadate（磷酸脂酶抑制剂，任选）

以上所有试剂均按比例溶于150 mM NaCl溶液中。

2. 冷的PBS中加入:

• 1 mM PMSF
• 15 mM EDTA
• 1 mM Na Vanadate（钒酸钠，任选）

3. 对数期生长状态良好的细胞，需准备75 cm²的培养瓶至少3-4个（90%以上生长面积）。

#### 二、实验步骤

1. 将长满细胞的培养瓶放置于冰上，用吸液管吸出培养液。加入足够的冷PBS用于洗涤细胞表面，以去除剩余培养基，倒掉PBS并重复此操作2-3次。在最后一次洗涤中尽可能吸干残留的PBS，尽量在冰上操作。

2. 向培养瓶中加入冷的RIPA裂解缓冲液（每75 cm²培养瓶加1 ml），然后用细胞刮刀沿瓶壁轻轻刮取细胞。如果需要处理同种细胞有多瓶，则将第一个瓶中刮好的细胞液吸出转入下一瓶中继续操作。由于处理后的细胞裂解液比较粘稠，建议使用直径稍大的吸液管。

3. 将吸出的细胞裂解液转移至14 ml离心管中（放置于冰上），然后重复步骤2以刮取剩余细胞。

4. 尽量将更多细胞裂解液收集到14 ml离心管中，样品放入冰盒进行超声处理。超声强度应以不产生泡沫为标准，每次超声2-3秒，重复3-4次。如仍有细胞碎片或沉淀，需以10000 rpm离心10分钟，保留上清液。

5. 取出少量细胞裂解液测定其蛋白浓度（可使用Biorad Bradford试剂盒或紫外分光光度计在A280处测定），分装后保存在-70℃。细胞裂解一般采用物理或化学方法。

#### 物理法

(1) 反复冻融：将细胞反复置于-20℃和25-30℃环境中，进行10-20次冷冻和解冻，适用于大部分哺乳动物细胞。

(2) 煮沸法：将细胞放置于100℃沸水中煮5-10分钟，适合大多数微生物细胞。

(3) 超声法：在超声破碎仪中以特定频率处理细胞，适用于大多数微生物细胞。

(4) 渗透压法：将细胞置于纯水等低渗溶液中，促进细胞吸水崩解。

(5) 液氮法：植物细胞可用液氮磨碎的方法进行处理。

#### 化学法

(1) 强酸、强碱溶液：如0.5 N NaOH溶液，可裂解大部分动物细胞和微生物细胞。

(2) 生物酶：如溶菌酶、蛋白酶K等，通常用来裂解微生物细胞。

在制备细胞裂解液的过程中，使用优质试剂和严格操控实验步骤是确保实验成功的关键。通过了解并掌握上述方法，科研工作者可以有效地为后续的蛋白质分析等实验打下基础。想了解更多相关内容，欢迎访问尊龙凯时人生就博。